西藏地区的主要乙肝病毒基因型CD杂交型

　［摘要］虽然在西藏高原地区有着大量的乙肝表面杭原阳性的群体，但是目前还未见报道来自这一地区的乙肝病毒（HBV）的DNA序列。因此我们将对26例乙肝表面杭原阳性的藏民血清中分离到的乙肝病毒进行定性研究。为了确定HBV的基因型及它的多基因联系，我们对两个基因部位进行了测序，其中一个包括preSl/preS2/S部位，另一个包括preC/C部位，并基于所处部位的不同而分为两种不同的基因型。为了更明确这一发现，我们又对代表不同组别的HBV基因组进行了测序，结果表明存在于西藏的HBV属于C基因型，而在C基因型中至少存在两种亚群，一为占多数的亚群为C/D杂交型，其血清型为ayw，另一为C基因型，其血清型为adw。本文首次报道来自西藏的HBV的全部核普酸序列，这一结果将有助于全球的关于重组HBV的研究，并促进来自这一地区的HBV的基因型及基因重组的探索。

　　引言：
　　虽然在世界的80多个国家已经加强了使用乙肝表面抗原疫苗及众多的免疫措施，HBV感染仍是一个主要危害公众健康的问题。目前在全世界范围内有约3亿5千万慢性携带者，其中约10％可能死于继发的肝硬化和肝细胞癌（Kane，1996）。过去20年的分子流行病学研究将HBVDNA序列分为7种基因型，A－G（Okamoto et al.，1986；Norder et al.，1992；Norder et al.， 1994；Stuyver et al.，2000）。HBV基因型的界定是基于以下定义：组别之间的全部基因组核昔酸序列的差别不低于8％，或表面基因的差别不低于4.1％（Okamoto et al.，1988；Norder et al.，1994；）。基因组的分布也表现出地理位置的特点，基因型A广泛分布于世界范围；基因型B和C主要见于亚洲；基因型D在欧洲南部、美洲和澳洲；基因型E主要见于非洲；基因型F发现于印地安人和玻利维亚人，而基因型G则主要在美国和欧洲（Stuyver et al.，2001）。在中国流行的HBV主要是基因型B和C（Zhu et al.，1999）。此外也观察到重组的基因型。多基因分析表明B/C重组体广泛存在于亚洲东部，A/ D重组体存在于意大利（Morozov et al.，2000）。
　　在西藏，有26.2％的人群为乙肝表面抗原阳性（Luo et al.，1993）。但是目前未见关于HBV的研究报道。未发现的基因型有可能在HBV的高感染率中起着重要的作用。通过对来自这一地区的HBV进行测序及多基因分析，我们发现西藏的主要的HBV基因型为C/D杂交型。
　　材料与方法：
　　研究对象：1000多份乙肝表面抗原阳性的血清样本，采自西藏自治区的主要城市（拉萨、日喀则、山南、那曲）无临床症状的HBV感染的中学生。这些学生均未观察到肝功能异常。所有的研究对象均为西藏人。26例样本乃随机抽取。在这26例分析样本的平均年龄为14.8岁。
　　HBVDNA的提纯和扩增：血清样本在－80（C中储存待测。病毒DNA提取自50（1含NP－40和0.75％的Tween－20的血清裂解液。对应于裂解基因组包括preC/C基因的1746nt到2502nt（片段A）及包括presl/preS2/S基因的2798nt到861nt的两个片段（片段B）进行PCR。片段A使用引物CH和CR1进行扩增，再用引物CF2和CR1进行半巢式反应。两种HBV的全部基因组使用表1中所列的引物进行扩增。扩增过程为

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